BIOTECNOLOGIA BLAVA

La biotecnologia marina és encara molt nova i estan desenvolupant-se ara les primerenques aplicacions. Aquest tipus de biotecnologia empra noves fonts procedents d'organismes marins amb finalitats industrials o bé per al desenvolupament de noves teràpies sanitaries. De fet, a Espanya són les empreses farmacèutiques qui fan més ús d'aquest tipus de ciència. Un exemple d'açò és la producció del primer medicament antitumoral desenvolupat a partir d'un organisme marí.

Altra aplicació es dirigeix al camp de la acuicultura. Gràcies a la manipulació genètica s'ha aconseguit millorar la cria d'especies marines, tot atenent a la fisiologia de l'organisme i també a l'entorn on viu. Per exemple, s'ha pogut desenvolupar mitjançant manipulació genètica unes algues enriquides que ajudan a una espècie de peix en la seua alimentació, de forma que s'ha garantit una dieta adaptada i adequada.

L'algologia (ciència que estudia les algues) també està emprant processos de biotecnologia marina per a millorar les espècies i aconseguir que les algues realitzen processos tecnològics com l'obtenció de nou ingredients alimentaris, cosmétics o el desenvolupament de nous medicaments. En aquest sentit, la biorremediació i l'obtenció de biocombustibles (Imatge) també son aplicacions molt novedoses i amb un futur prometedor.

BIOTECNOLOGIA GROGA

El terme biotecnologia groga fa referència a la branca de la biotecnologia dedicada a l'optimització de processos industrials; busca reemplaçar a les tecnologies més contaminants per altres més netes ó com es diu a l'anglés environmentaly-friendly.

L'ús d'enzims ó biocatalitzadors és un dels avanços més significaitus en aquest tipus de biotecnologia. Els avantatges del seu ús resideixen en l'alta selectivitat i eficiència dels enzims modificats en comparació amb altres enzims o processos químics. Així, els processos químics convencionals requereixen alta pressió i temperatura i els enzims, en canvi, treballen a baixa pressió i temperatures que no superen els 50ºC. A més a més, els enzims són biodegradables i molts d'ells poden actuar en medis orgànics amb alta concentració de sals. Aquests enzims s'apliquen a dies de hui a pràcticament totes les àrees industrials: farmacèutica, alimentària,química, textil, detergents, paper, etc.

Els detergens són, de fet, el millos exemple de com l'ús d'enzims disminueix els costos, perquè la neteja de roba i altres objectes requereix de molt menys energia.

Altre exemple molt significatiu és l'aplicació de la biotecnologia a la indústria del paper i la cel·lulosa. En el procés de tractament de la fusta, l'eliminació de la lignina requereix altes temperatures i tractaments amb oxígen i clor, la qual cosa produieix residus clorats molt tòxics. No obstant això, amb l'utilització de xilanases (enzims que degraden el xilà i la lignina associat a aquest), evita la producció de productes de deixalla tòxics.

Però, aquest tipus de biotecnologia és més conegut per la producció d'aliments que precisen de la intervenció de microorganismes, com és el pà, la cervessa, el formatge i els iogurts. En aquest sentit, la biotecnologia s'encarrega de la millora dels llevats per augmentar la qualitat i la velocitat de producció del produce final. 

BIOTECNOLOGIA VERMELLA

L'Objectiu d'aquesta entrada és l'explicació de les àrees d'aplicació de la biotecnologia en la medicina: 

- Diagnòstic mol·lecular y pronòstic de malalties: en l'actualitat trobem molts productes de diagnòstic, els quals s'empren per a la detecció d'agents infecciosos (com el VIH i l'hepatitis.) Així mateiz, el diagnòstic de les malalties basaddes en  l'ADN ha començat a implantar-se en la pràctica clínica per a nombroses malalties genètiques i per a la determinació de la predisposició genètica al patiment de certes malalties.

- Nous fàrmacs: la biotecnologia permit disenyar i produir noves proteïnes, les quals poden ser empleades com tractament enfront de malalties infeccioses, diabetis, desordres hematològics, malalties cardiovasculars i càncer. 

Als últims anys em començat a parlar de medicina personalitzada, basada en farmacogenòmica; aquest nou camp d'investigació consisteix en l'estudi de la resposta del pacient als fàrmacs depenent del seu perfil genòmic; açò permetrà el desenvolupament de teràpies individualitzades què milloren la seua efectivitat i disminueixen els efectes secundaris.  

-Vacunes: les vacunes clàssiques s'obtenen inactivant, atenuant o fraccionant agents infecciosos, els quals posteriorment s'introdueixen en el pacient per induir la resposta immune. La biotecnologia y la genòmica han cambiat la manera en la qual es disenyen les vacunes i han permés obtenir vacunes més segures produides mitjançant enginyeria genètica; aquestes noves vacunes contenen únicament mol·lècules aïllades què indueixen la resposta immune. D'aquesta forma eliminem el risc d'infecció.

- Teràpies regeneratives: trobem ací les teràpies cel·lulars, basades en l'aplicació de cèl·lules mare per al tractament de malalties, i l'enginyeria de teixits, què consisteix en la construcció de sustituts biològics d'òrgans i teixits al laboratori. Les cèl·lules mare emprades a les teràpies cel·lulars procedeixen o bé de teixits adults, o bé de teixits embrionaris. Aquest tipus de teràpies encara estan en vies de desenvolupament, degut a la dificultat en el cultiu, diferenciació i administració de cèl·lules mare. 

- Terapia gènica: consisteix en la introducció de material genètic en les cèl·lules d'un ésser humà per prevenir ó guarir certes malalties. No obstant què aquestes teràpies permetrien revertir la malaltia permanentment, encara queden massa interrogants al respecte de la seua eficàcia i seguretat. A dies de hui, no existeix cap teràpia gènica aprovada. 

BIOTECNOLOGIA VERD

Com ja vaig comentar a l'entrada anterior, trobem diferents tipus de biotecnologia. En aquesta entrada, doncs, desenvoluparé les aplicacions de l'anomenada biotecnologia verd, que és aquella que empra majoritariament plantes; dins de les aplicacions biotecnològiques en aquest camp d'investigació, ens trobem tres àrees diferenciades: 

• La Biotecnologia alimentària, què utilitza tècniques y processos que empren organismes vius o les seues substàncies per a produir o modificar un aliment, millorar les plantes i desenvolupar microorganismes què intervinguen en la seua elaboració. Els exemples de biotecnologia verd més coneguts són la producció de nou aliments funcionals, com són els probiòtics i prebiòtics, la seguretat alimentària, etc.

• La Biotecnologia agrícola fa referència a l'aplicació de tècniques biotecnològiques per a la millora dels cultius. Un exemple és la utilització de l'enginyeria genètica (plantes obtingudes al laboratori) amb l'objectiu de defensar els cultius de l'atac de plagues, protegir-los del fred i de la sequera; també estalvia la utilització de biofertilitzants para el crexement de las plantas.

• La Biotecnologia ambiental aplica els processos biotecnològics per a la protecció i restauració de la qualitat del mediambient. Actualment, una de les principals aplicacions de la biotecnologia ambiental és la neteja de la polució, aigües residuals, purificació de l'aire i gasos de deixalla; aquestos procediments són coneguts en conjunt com processos de biorremediació (ús de sistemes biològics per a la reducció de la pol·lució de 'aire i dels sistemes acuàtics i terrestres).Cada vegada més, la industria estè dessenvolupant processos en esta àrea de prevenció, amb la finalitat de reducir l'impacte ambiental.

QUÈ ÉS LA BIOTECNOLOGIA?

Podem trobar moltes definicions de biotecnologia als diccionaris, però abans de explicar què és exactament, hem de parar-nos a pensar els arrels que composen aquesta paraula. En primer lloc trobem l’arrel bio, del grec βίος, «vida»; en segon lloc τέχνη [-tecne-], «destresa» i per últim -λογία [-logia], «estudi, ciència»). Doncs, una primera definició, tenint en compte únicament la composició de la paraula podria ser “Estudi i utilització d’organismes vius”. I això descriu bàsicament què és la biotecnologia : segons el Conveni sobre Diversitat Biològica de 1992, biotecnologia es considera “tota aplicació tecnològica què empre sistemes biològics i organismes vius ó els seus derivats per a la creació o modificació de productes o processos per usos específics".

Encara que el terme va ser encunyat fa només un segle (per l’enginyer hongarès Károly Ereki a l’any 1919) els processos que fan servir éssers vius s´han emprat fa més de 3000 anys, com es ara la producció de pa i cervesa (fermentació) o l’enriquiment de sols per a cultiu amb nitrogen (bacteris fixadors). No obstant això, no es van assabentar del paper d’aquestes organismes als processos fins el segle XVIII.

La biotecnologia s’encarrega tant de la investigació bàsica (descobriment del funcionament d’un procés biològic) com de investigació aplicada (ús dels processos amb l’objectiu d’obtenir productes o beneficis de qualsevol tipus); esta ciència integra diferents àrees de les ciències biològiques, com la biologia cel·lular i molecular, la bioinformàtica i la microbiologia marina aplicada. A més a més, la biotecnologia fa ús de la enginyeria genètica per obtenir organismes modificats o millorats.

Com què la biotecnologia s’empra a totes les àrees de la vida, podem distingir quatre tipus diferents, en funció dels organismes emprats i l’ús o aplicacions derivats:

- Biotecnologia vermella: utilització de una gran varietat d’organismes vius (des de virus fins a animals) relacionat a l’àmbit mèdic. 

- Biotecnologia blanca: utilització de bacteris, fongs i algues (majoritàriament) als processos industrials. 

- Biotecnologia verda: obtenció i modificació de plantes i microorganismes i insectes relacionats a les plantes per a usos agrícoles i mediambientals. 

- Biotecnologia blava: explotació dels recursos de la mar per obtenir substàncies d’interès farmacèutic i industrial. 

Com ja heu observat, la biotecnologia és una ciència que recull tots els àmbits cientificotècnics. Si us interessa saber més coses, continueu llegint les següents entrades al Blog!

MÈTODES DE CULTIU

Un dels sistemes més importants per a la identificació de microorganismes és observar el seu creixement en substàncies alimentàries artificials preparades al laboratori. Aquest material s’anomena Medi de Cultiu.

Per al correcte creixement dels bacteris, fongs, llevats i altres microorganismes el medi de cultiu ha de tindre unes condicions de temperatura, humitat, llum, pressió d’oxigen (en cas de microorganismes aeròbics) i alcalinitat adequades per a cadascun. A més a més, ha de contenir nutrients i factors de creixement necessaris. Cada microorganismes posseeix unes característiques de cultiu concretes; però aquesta raó, trobem medis de cultiu tan diferents com agar, sang completa, sèrum, bilis, etc. En alguns casos també s’afegeixen indicadors al medi amb l’objectiu de detectar la formació d’àcid o el creixement de bacteris no desitjats (contaminants).

Podem trobar diferents tipus de medis (imatge), depenent de l’ús al qual van destinats:

-       - Medis generals: la característica principal d’aquestes medis és què permeten el creixement de tot tipus de microorganismes (medis molt complets).

- Medi selectiu: posseeix característiques especials que únicament permeten el creixement de una espècie o grup determinat.

- Medi diferencial: permet el desenvolupament de diferents organismes però permet la selecció de un en concret pel seu metabolisme, respiració, etc.

- Medi de enriquiment: conté els nutrients necessaris però suportar el co-creixement de dos o més microorganismes de manera controlada.

- Medi mínim: solament permet el creixement de un tipus de microorganisme degut a que els nutrients del medi es troben en quantitats inferiors a les idònies.

- Medi de transport: preparat per emmagatzemar temporalment a microorganismes i mantindré la seua viabilitat.

VIRUS I PRIONS

Virus

En biologia, un virus és un agent infecciós submicroscòpic acel·lular que solament pot multiplicar-se dins de les cèl·lules d'altres organismes. Els virus infecten tots els tipus d'organismes, des d'animals, fongs, plantes, fins a bacteris i arqueges i fins i tot altres virus. Els virus són massa petits per poder ser observats amb l'ajuda d'un microscopi òptic, per la qual cosa es diu que són submicroscópicos; encara que existeixen excepcions entre els Virus nucleocitoplasmàtics d'ADN de gran grandària, tals com el Megavirus chilensis, el qual s'aconsegueix veure a través de microscopia òptica.

Els virus es componen de dues o tres parts: el seu material genètic, que porta la informació hereditària, que pot ser ADN o de ARN; una coberta proteica que protegeix a aquests gens anomenada càpside i en alguns també es pot trobar una bicapa lipídica que els envolta quan es troben fora de la cèl·lula, denominada embolcall víric (com el virus que trobem a la imatge). Els virus varien en la seua forma, des de simples helicoides o icosàedres fins a estructures més complexes. L'origen evolutiu dels virus encara és incert, alguns podrien haver evolucionat a partir de plasmidis (fragments d'ADN que es mouen entre les cèl·lules), mentre que uns altres podrien haver-se originat des de bacteris.

No tots els virus provoquen malalties, ja que molts virus es reprodueixen sense causar cap dany a l'organisme infectat. A més, són moltes les aplicacions que es poden extreure d'ells, com per a l'estudi dels mecanismes bioquímics bàsics (a causa que són sistemes molt senzills); també s'utilitzen com a vectors per introduir gens de forma controlada en diferents cèl·lules. En general, són agents àmpliament usats en biotecnologia i biomedicina, ja que poden considerar-se com a nanopartícules portadores de material biològic d'interès fàcilment dirigibles a una diana concreta.

Prions

Un prió és un agent infecciós format per una proteïna denominada prionica capaç de formar agregats moleculars aberrants. La proteïna del prió és una sialoproteína patògena, la qual té alterada la seua estructura secundària, tenint un incorrecte plegament de la seva estructura terciària. A diferència de la resta dels agents infecciosos (virus, bacteris, fongs etc.), que contenen àcids nucleics (ja siga ADN, el ARN, o tots dos), un prió solament està compost per aminoàcids i no presenta material genètic.

Els prions es propaguen mitjançant la transmissió de proteïnes anòmales amb mal plegament. Quan un prió entra en un organisme sa, actua sobre la forma normal del mateix tipus de proteïna existent en l'organisme, modificant-la i convertint-la en prió (observem els canvis a la proteïna en la imatge). Aquests prions recentment formats poden passar a convertir més proteïnes, provocant una reacció en cadena que produeix grans quantitats de la proteïna prió.

Actualment hi ha molt poca informació sobre la funció que tenen les proteïnes priónicas en estat no patogen, pero alguns experiments han demostrat que tenen un paper actiu en el correcte desenvolupament neuronal, degut a que és una proteïna capaç d'unir específicament Cu2+ (processos de oxidoreducció), i també s'han relacionat els prions amb proteïnes de transducció de senyals, d'adhesió cel·lular i amb la regulació i distribució dels receptors d'acetilcolina.

PROTOZOUS, FONGS I ALGUES

Protozous

En biologia el regne Protoctista, és el que conté a tots aquells organismes eucariotes que no poden classificar-se dins d'algun dels altres tres regnes eucariotes: Fungi (fongs), Animalia (animals) o Plantae (plantes) . És un grup parafilètic (un grup que no conté tots els descendents del seu avantpassat comú) , en el que hi ha representants de característiques molt variades, com explique més avant. Com què no són un grup monofilètic, és impossible especificar característiques que els definisquen o distingisquen en el seu conjunt. Les característiques comunes són les pròpies dels eucariotes en general, així que són compartides, excepte pèrdua secundària, per plantes, animals o fongs.

Una de les característiques compartides per tots ells és que cap dels seus representants està adaptat plenament a l'existència en l'aire, de manera que els que no són directament aquàtics, es desenrotllen en ambients terrestres humits o en el mig intern d'altres organismes. Quant a la grandària, trobem tant unicel·lulars com pluricel·lulars (aconseguint inclús grandàries de desenes de metres com és el cas de les algues terroses del gènere Laminària) . Molts dels protistes pluricel·lulars compten amb parets cel·lulars de variada composició, i els unicel·lulars autòtrofs sovint estan coberts per una tec, com en cas destacat de les diatomees, o dotats d'escates o reforços. Els unicel·lulars depredadors solen presentar cèl·lules nues (sense recobriments) . Les formes unicel·lulars sovint estan dotades de mobilitat per reptació o, més sovint, per apèndixs dels tipus cridats cilis i flagells.

Els protistes es compten entre els organismes més importants que componen el plàncton (organismes que viuen en suspensió en l'aigua) , el bentos (del fons d'ecosistemes aquàtics) i de l'edafón (de la comunitat que habita els sòls). Hi ha molts casos ecològicament importants de parasitisme i també de mutualisme, com els dels flagel·lats que intervenen en la digestió de la fusta o els que habiten en el rumen de les vaques.

Fongs

En biologia, el terme vaig exercir designa a un grup d'organismes eucariotes entre els que es troben les floridures, els rents i els organismes productors de bolets. Encara que la major part dels organismes d'este regne són macroscòpics, també n'hi ha microscòpics (com observem a la imatge), com és el cas dels rents. Són heteròtrofs i tenen parets cel·lulars compostes per quitina; s'alimenten per absorció, com les plantes.

Els fongs es troben en hàbitats molt diversos i segons la seua ecologia es poden classificar en quatre grups: sapròfits, liquenitzats, micorrizògens i paràsits. En la majoria dels casos solen viure en sòls i junts a materials en descomposició i com a simbionts de plantes, animals o altres fongs. Els fongs són els descomponedors primaris de la matèria morta de plantes i d'animals en molts ecosistemes, i com a tals posseïxen un paper ecològic molt rellevant en els cicles biogeoquímics. A més, també tenen gran importància econòmica, ja que s'utilitzen en molts processos biotecnològics industrials, com és la fermentació de la cervesa i el pa i també en l'àrea del cultiu i recol·lecció de bolets per a la indústria alimentària. També són grans productors d'antibiòtics. Junt amb bacteris, són els microorganismes més empleats en els processos biotecnològics, com veurem més avant.

Algues 

Les algues microscòpiques són els únics procariotes capaços de realitzar fotosíntesis oxigènica. Es classifiquen a un filum (Cyanobacteri) del domini Bacteria.

Els cianobacteris més comuns són unicel·lulars cocoides (esferoïdals), de vegades agregades en una càpsula mucilaginosa, o formant filaments simples. Els filaments poden aparèixer agregats en feixos, embolicats per mucílag, o d'una manera que aparenta ramificació. Existeixen, a més, cianobacteris que formen filaments amb ramificació veritable.

Els primers indicis de l'existència de cianobacteris es remunten a 2.700 milions d'anys. És inqüestionable el seu paper clau en l'acumulació d'oxigen en l'atmosfera que va tenir lloc fa 2.500 milions d'anys, com a resultat de la fotosíntesi oxigènica, i que va suposar un canvi transcendental en les condicions ecològiques per a la vida a la Terra.

Està ben documentat que els cianobacteris, gràcies a un metabolisme secundari molt actiu, són capaços de sintetitzar un gran nombre de compostos orgànics com a antibiòtics, antivirals, antitumorals, i també altres compostos nefasts com la geosmina i el 2-metil-isoborneol, que confereix a l'aigua d'aixeta un sabor desagradable. Cal afegir a tots aquests composts toxines responsables de diversos episodis coneguts de mortalitat de vertebrats (peixos, així com bestiar i altres animals que beuen de les aigües afectades) per ingestió de cianobacteris concentrades en la riba per l'acció del vent.

BACTERIS I ARQUEGES

Bacteris i arqueges

Els bacteris són microorganismes procariotes (no tenen el nucli definit ni presenten, en general, orgànuls membranosos interns) que presenten una grandària d'uns pocs micròmetres i diverses formes. Les formes més comunes són: filaments, esferes (cocos), barres (bacils), llevataps (vibris) i hèlices (espirils). Generalment posseïxen una paret cel·lular i esta es compon de peptidoglican i moltes disposen de flagells o d'altres sistemes de desplaçament, per la qual cosa són mòbils. 

Encara que el terme bacteri incloïa tradicionalment a tots els procariotes, actualment la taxonomia i la nomenclatura científica els divideix en dos grups. Estos dominis evolutius es denominen Bacteria i Archaea (arqueges) . La divisió es justifica en les grans diferències que presenten ambdós grups a nivell bioquímic i genètic. 

Els bacteris són els organismes més abundants del planeta. Són ubiqües, es troben en tots els hàbitats terrestres i aquàtics, inclús en aquells ambients més extrems com en els brolladors d'aigües calentes i àcides, en rebutjos radioactius, en les profunditats del mar i escorça terrestre. A banda, tenen un paper ecològic molt definit e imprescindible per al desenvolupament dels cicles naturals de la terra; a més a més, moltes d’elles son necessàries per a la vida de molts éssers vius (inclosos els humans) tot i que algunes son patògenes.

Les arqueges són un grup de microorganismes unicel·lulars que, igual que els bacteris, tenen morfologia procariota i encara que són bastant similars en grandària i forma, algunes arqueges tenen formes molt inusuals, com les cèl·lules aplanades i quadrades. Malgrat aquesta semblança visual amb els bacteris, les arqueges posseeixen gens i diverses rutes metabòliques que són més properes a les dels eucariotes, especialment en els enzims implicats en la transcripció i la traducció.

Inicialment, les arqueges eren considerades totes metanògenes o extremòfiles que vivien en ambients hostils tals com a aigües termals i llacs salats, però actualment es troben arqueges en els més diversos hàbitats, tals com el sòl, oceans, pantans i en el còlon humà. Actualment es consideren una part important de la vida a la Terra i podrien exercir un paper important en el cicle del carboni i en el cicle del nitrogen.

MICROORGANISMES. UNA MICA D’HISTÒRIA

Un microorganisme és un ésser viu, o un sistema biològic, que només pot visualitzar-se per mitjà de tècniques microscòpiques. Són organismes dotats d'individualitat i què presenten una organització biològica senzilla (a diferència de plantes i animals, les quals presenten estructures cel·lulars organitzades molt més complexes) .

El concepte de microorganisme no té cap implicació taxonòmica o filogenètica atés que engloba organismes unicel·lulars i pluricel·lulars no relacionats evolutivament entre si, tant procariotes com eucariotes , una part de les algues i els fongs, i inclús entitats biològiques acel·lulars de grandària ultramicroscòpica, com els virus o els prions. Estos últims generalment no són considerats éssers vius i, per tant, no són microorganismes en sentit estricte; no obstant això, també estan inclosos en el camp d'estudi de la microbiologia.

Però, des de quan tenim coneixement de l'existència d'estos microorganismes? Doncs bé, ja en el segle XVII van començar a estudiar-los. Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) i el seu contemporani Robert Hooke van ser els primers a observar els microorganismes, utilitzant microscopis de disseny propi. En 1665 Robert Hooke va descriure les observacions realitzades pel microscopi en el seu llibre Micrographia i va encunyar el terme de cèl·lula. Estos descobriments foren fonamentals per començar a entendre processos que abans eren un misteri, como ara com el raïm podia convertir-se en vi, com la llet es transformava en formatge o bé per què els aliments es deterioraven. Tot allò, junt amb els descobriments posteriors, acabaren amb la creença antiga de què la vida apareixia espontàniament a partir de substàncies mortes.

Als segles posteriors es van dur a terme alguns experiments importants per l’avanç de la microbiologia:

- Lazzaro Spallanzani (1729-1799) va trobar que bullint caldo matava als microorganismes que es trobaven en ell i que els nous microorganismes només podien instal·lar-se en un caldo si este s'exposava a l'aire.

- Louis Pasteur (1822-1895) va ampliar les troballes de Spallanzani per mitjà de l'exposició de caldos bullits a l'aire, en recipients que contenien un filtre que evitava que qualsevol partícula arribara al mig de creixement, i també en recipients sense cap filtre, que admetien aire a través d'un tub corbat que no permetria que les partícules de pols entraren en contacte amb el caldo. Va observar que res creixia en els caldos en el curs de l'experiment, la qual cosa significava que els organismes vius que creixien en estos caldos venien des de fora, com a espores en pols, en compte de generar-se espontàniament en el caldo. Per tant, Pasteur va donar el colp definitiu a la teoria de la generació espontània.

- En 1876, Robert Koch (1843-1910) va establir que els microorganismes poden causar malalties, per què va trobar que la sang de bestiar infectat amb àntrax sempre tenia un gran nombre de Bacillus anthracis i que podia transmetre esta malaltia prenent una xicoteta mostra de sang de l'animal infectat i injectant-la en un sa. També va descobrir que podia fer créixer el bacteri en un caldo nutrient, que causava la malaltia al ser injectat en un animal sa. Basant-se en estos experiments, va idear els criteris per a establir una relació causal entre un microorganisme i una malaltia, ara coneguts com els postulats de Koch.

L’avanç de les tècniques d’investigació al segle XX van permetre un augment ràpid sobre el coneixement dels microorganismes que fins i tot continua al present.